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　　ELISA操作指南：从板子准备到结果分析

　　以下是ELISA实验从板子准备到结果分析的完整操作指南，结合高可信度来源和富媒体资源整理：

　　一、实验前准备

　　试剂与耗材?

　　需准备包被板、标准品、生物素化抗体、酶标二抗、TMB显色液及终止液等?

　　试剂需室温平衡1小时，冻存样本需4℃缓慢解冻?

　　样本处理?

　　血清/血浆需3000×g离心15分钟去除纤维蛋白，细胞上清需0.22μm过滤?

　　建议进行预实验确定最佳稀释比例(通常5-10倍梯度稀释)?

　　二、实验操作流程

　　包板与封闭?

　　用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释抗原/抗体(1-10 μg/mL)，每孔加100μL，4℃过夜或37℃孵育2小时?

　　封闭液推荐5% BSA或脱脂奶粉，室温孵育1-2小时?

　　加样与孵育?

　　标准品需2倍稀释系列(如640pg/ml至0pg/ml)，每浓度设2个复孔

　　样本与标准品加样需在15分钟内完成，37℃孵育30-60分钟?

　　洗涤关键步骤?

　　每孔加300μL洗涤液，震荡浸泡1-2分钟，重复3-5次，拍干时避免液体残留?

　　三、显色与读数

　　显色反应?

　　每孔加100μL TMB底物，避光孵育5-30分钟(显色梯度需肉眼观察)?

　　终止液(如2M硫酸)加入后15分钟内用酶标仪测450nm吸光值?

　　结果分析?

　　标准曲线需R2>0.99，样本OD值需在标准曲线线性范围内?

　　阳性判定：样本OD值>阴性对照2.1倍?

　　常见问题处理

　　高背景?：可能因洗涤不充分或封闭不足，需增加洗涤次数或更换封闭液?

　　显色异常?：检查底物有效期或孵育时间，避免气泡干扰?

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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