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以下是本生技术小编对ELISA试剂盒实验操作的规范详解，结合双抗体夹心法的通用流程及注意事项：
一、实验前准备?
试剂平衡?
试剂盒从冰箱取出后，需室温平衡20-30分钟(避免温度差异影响反应)?。
设备校准?
移液器需定期校准，选择密封性好的枪头，避免加样误差(误差可超5%)?。
二、加样规范?
标准品与样本处理?
标准品需按说明书涡旋溶解，静置10-30分钟至溶解，避免吹打导致蛋白损失?。
样本需离心(2000×g，15分钟)去除颗粒物，血清/血浆避免溶血或脂血干扰?。
加样操作?
垂直悬空加液，避免贴壁或产生气泡，每孔加样量需一致(如50μL标准品或样本)?。
建议设置复孔(至少2孔/样本)，提高数据可靠性?。
三、孵育与洗涤?
孵育条件?
37℃恒温箱孵育60分钟(双抗体夹心法)，封板膜密封防止蒸发?。
震荡孵育可增强抗原抗体结合效率(OD值更高)?。
洗涤步骤?
手工洗板：每孔加满洗涤液(350μL)，静置1分钟后拍干，重复5次?。
机器洗板：检查冲洗头是否堵塞，确保洗涤净。
四、显色与检测?
底物反应?
加入TMB底物后避光孵育15分钟，显色呈蓝色?。
终止液加入后5分钟内测定OD值(450nm)，避免延迟导致信号衰减?。
数据计算?
标准曲线需线性良好(R2≥0.99)，样本浓度通过曲线方程计算?。
五、常见问题与解决?
问题? ?可能原因? ?解决方案?
空白孔OD值过高 洗涤不净或试剂污染 更换新鲜洗涤液，重复洗板?
平行孔CV值>10% 加样误差或孵育温度波动 校准移液器，使用恒温箱?
显色不均匀 底物混合不充分 显色前充分摇匀试剂?
六、关键注意事项?
试剂保存?：未用完板条需密封干燥保存，浓缩洗涤液结晶需37℃水浴溶解?。
样本稀释?：若说明书要求稀释样本(如5倍)，最终结果需乘以稀释倍数?。
以上规范适用于多数ELISA试剂盒，具体操作需以试剂盒说明书为准。实验失败时建议优先检查加样精度和洗涤步骤?。
注：以上资料仅供参考，具体其他信息请咨询技术老师或品牌供应商。
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