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　　ELISA实验常见问题分析与解决方案

　　一、显色异常问题

　　白板(无显色)?

　　原因?：试剂失活(如HRP污染或底物失效)、漏加关键组分(酶标抗体/显色剂)、孵育温度或时间不足?。

　　解决?：更换新鲜试剂，检查加样步骤，确保37℃孵育1-2小时并避光?。

　　高背景/非特异性显色?

　　原因?：封闭不充分(如BSA浓度不足)、洗涤不净(残留未结合物质)、抗体浓度过高或交叉反应?。

　　解决?：优化封闭条件(延长至1-2小时)，增加洗涤次数(5次，每次1分钟)，调整抗体稀释比例?。

　　二、重复性差

　　加样误差?：复孔间加样量或时间不一致，导致CV%>20%?。

　　洗板不均?：洗板机管道阻塞或手工洗板力度不一致?。

　　解决方案?：使用同一移液器，规范加样速度;检查洗板机或手动充分拍干?。

　　三、假阳性/假阴性

　　假阳性?

　　溶血/细菌污染?：红细胞释放过氧化物酶或细菌内源性HRP干扰?。

　　类风湿因子(RF)?：与IgG Fc段非特异性结合?。

　　处理?：离心去除溶血样本，添加RF阻断剂?。

　　假阴性?

　　抗原降解?：反复冻融或保存时间过长?。

　　竞争法操作错误?：如先加酶标抗体后加样本?。

　　处理?：分装冻存样本，严格按说明书顺序加样?。

　　四、标准曲线异常

　　标曲拟合差(R2<0.99)?：标准品稀释错误或酶标仪波长设置不当?。

　　批间差异?：不同批次试剂活性波动，可用校正因子“S"校准历史数据?。

　　五、关键操作注意事项

　　加样?：枪头悬空加至孔底，避免触碰孔壁或溅洒?。

　　孵育?：覆盖封板膜防止蒸发，避免叠放导致温度不均?。

　　洗涤?：使用含0.05% Tween-20的洗涤液，拍干?。

　　六、其他常见问题

　　边缘效应?：周边孔显色偏强，建议质控孔置于板中央?。

　　酶标板选择?：聚苯乙烯板需评估吸附性能，避免批次差异?。

　　(注：具体问题需结合试剂盒说明书及实验条件调整?。)

　　注：以上资料仅供参考，不作为实验数据，具体请咨询品牌供应商或技术老师;

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