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　　实验干货——PCR试剂盒注意事项与原则

　　PCR试剂盒注意事项：

　　①加入试剂的顺序，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

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　?、郯凑占ρ斓鞍?HB)ELISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

　　④底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

　?、菹吹?strong>酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

　　⑥使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器 。

　　⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

　　⑧试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

　?、岵挥玫钠渌约劣Π昂没蚋呛谩２煌诺氖约敛灰煊?。保质前使用。

　　PCR试剂盒原则：

　?、僖锍ざ龋?15-30bp，常用为20bp左右。

　?、谝锢┰隹缍龋?以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　?、垡锛罨篏+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　?、鼙苊庖锬诓砍鱿侄督峁?，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

　　⑤引物3'端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

　?、抟镏杏谢蚰芗由虾鲜实拿盖形坏悖?被扩增的靶序列有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

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